Química

Introducción a la Toxicología Forense

Toxicología es la parte de la química que se ocupa de las sustancias que introducidas al organismo, por alguna de las vías que luego enumeraremos, ocasiona daño a la salud en mayor o menor grado.

De acuerdo a lo anterior,  tóxico es cualquier sustancia de naturaleza orgánica o inorgánica, que introducido a un organismo vivo puede ocasionar daño. En numerosas ocasiones esta propiedad de ocasionar trastornos está relacionada con la cantidad de la sustancia incorporada, es decir de la dosis.

Muchas sustancias en determinadas cantidades no tienen efectos tóxicos, eventualmente pueden llegar a ser terapéuticos, sin embargo cuando estas cantidades son superadas pueden producirse efectos indeseados. Es común en sustancias medicamentosas apreciar esta propiedad, es por ello que debe diferenciarse dosis tóxica de dosis terapéutica. En un medicamento, cuanto más separada esté una de la otra más eficaz y más seguro será el mismo, aquellos medicamentos que tienen ambas dosis muy cercanas son riesgosos para su utilización.

Se define dosis tóxica como la cantidad de sustancia con la cual pueden evidenciarse los efectos nocivos, si la dosis es suficiente los daños pueden ser irreversibles produciendo la muerte del sujeto receptor, como las variaciones en las cantidades necesarias para producir el óbito pueden variar con relación a diversos sujetos se habla de dosis letal 50,  definiéndose como la dosis que produce la mortandad en el 50 % de sujetos de un lote de experimentación.

Cuando se definió toxicología se mencionó que las sustancias deben ser introducidas en el organismo, eso significa que las mismas deben ser absorbidas y distribuirse por el torrente sanguíneo para desarrollar su acción tóxica. En efecto hay sustancias que por sus características aun ingeridas no ejercen su efecto por no ser absorbidas, es el caso del Mercurio metálico, el cual tiene efecto tóxico cuando es inhalado y sin embargo si es ingerido, por no ser absorbido en el tracto digestivo,  no ejerce su efecto tóxico. Recordemos que antiguamente se utilizaba ingerirlo en caso de obstrucciones intestinales, pues es eliminado intacto por vía fecal.

Vías de introducción de sustancias tóxicas.

                

a)      Vía oral.  De esa manera pueden ser incorporadas sustancias tóxicas en estado líquido o sólido, pudiendo producirse la absorción en la mucosa del tracto digestivo a partir de la mucosa bucal, estomacal y/o intestinal.

b)       Vía parenteral,  por inyección ya sea subcutánea, intramuscular o más comúnmente intravenosa, de esta manera se introducen numerosas sustancias toxicomanígenas, que por supuesto cumplen con la definición de tóxicos.

c)      Vía inhalatoria,  por esta vía se introducen numerosos tóxicos volátiles como gases o vapores, ya se mencionó el caso del Hg que por su elevada tensión de vapor se absorbe en función de su alta volatilidad como vapor de Hg. También podría incorporar en este caso a la Cocaína que es inhalada en estado sólido aprovechando su fácil absorción en la mucosa nasal.

d)      Vía rectal,  esta vía utilizada en terapéutica con la forma farmacéutica, supositorios. Con frecuencia constituye vía de intoxicación en el caso de sujetos que se introducen envoltorios de plástico de forma cilíndrica con drogas de abuso intentando pasar de esa manera los controles aduaneros produciéndose por accidente la ruptura de los mismos con la liberación del material contenido y la correspondiente intoxicación por sobredosis.

e)      Vía vaginal,  del mismo modo que la anterior suele utilizarse terapéuticamente con óvulos. En el tema que nos interesa se utiliza la cavidad vaginal para el transporte de envoltorios como los mencionados, también para superar las barreras aduaneras y policiales en él trafico de drogas.

f)        absorción cutánea, no es de lo más común pero puede suceder que una sustancia         pueda superar la barrera cutánea accidentalmente, fundamentalmente cuando la dermis esta alterada, por lesión y/o erosión de la piel.

Tipos de intoxicación.

Las intoxicaciones pueden ser intencionales o accidentales,  y por el tipo de dosis utilizada las podemos clasificar en agudas o crónicas.

Un intento de suicidio será entonces una intoxicación intencional y aguda, pues obviamente existen las dos circunstancias el voluntarismo por parte del suicida y la necesidad de una dosis elevada para asegurar el objeto deseado.

También un intento de homicidio por envenenamiento será una intoxicación intencional, pero aquí puede darse la circunstancia de agudo o crónico según la dosis utilizadas para lograr el objetivo.

El envenenamiento con  Cianuro de Sodio,  generalmente es con  una dosis alta para lograr la muerte con una sola ingesta, sería el caso de la pena capital en cámara de gas o el sonado caso de Yiya Murano y sus tres víctimas muertas con confituras conteniendo esta sal.

El segundo caso sería,  el ya comprobado envenenamiento de Napoleon en la Isla de Santa Elena,  utilizando arsénico como droga tóxica, suministrándolo en pequeñas cantidades reiteradamente, produciendo el deterioro paulatino del sujeto intoxicado hasta lograr su deceso. Casos similares se han visto también con Talio, el cual era suministrado a la víctima paulatinamente con el objetivo de producir el deceso tras un largo periodo de deterioro orgánico.

De manera similar pueden diferenciarse intoxicaciones accidentales de uno u otro tipo. Las agudas en el caso de accidentes industriales con derrames, o escapes de sustancias tóxicas en cantidades masivas que afectan en mayor o menor grado a operarios y/o población civil presente en la zona afectada. Por ej. Podríamos citar el caso de intoxicación con CNH hace unos años en Avellaneda, producido por emanaciones de este gas desde las cloacas en donde por desidia, ignorancia o indiferencia se había producido derrames de soluciones de cianuro y también derrames ácidos que permitieron la realización de la reacción de generación del gas cianhídrico.

           

Las intoxicaciones accidentales crónicas también son frecuentes en actividades industriales, en donde sin haber intencionalidad existe una exposición reiterada al agente tóxico provocando una incorporación lenta y paulatina del elemento intoxicante. Se podría citar aquí la exposición al  plomo en la industria de cerámicas y pinturas y también el sonado caso de la impregnación masiva de bebes al Mercurio en el año 1982, por la utilización de pañales reutilizables comercializados por una empresa llamada Pañalera.

Elementos a analizar para detectar una intoxicación

El tipo de muestra a utilizar para la detección de una intoxicación determinada variará según las circunstancias como podemos enumerar.

En una situación de intoxicación aguda, ya sea accidental o intencional, los materiales a utilizar para tratar de evitar la muerte de la víctima, podrán ser: contenido estomacal, para lo cual se efectúan los lavados correspondientes, vómitos, sangre u orina de la víctima, materiales de diversos tipos halladas en donde se encontró al sujeto, vasos,   restos de comida o bebidas, medicamentos, polvos sospechosos, etc., en el caso de accidentes se debe tener en cuenta los elementos utilizados en el sector en donde se produjo el accidente.  Encarando en cada caso el tratamiento químico correspondiente.

Si la intoxicación ha sido mortal, a los materiales mencionados previamente debe sumarse las vísceras producto de la autopsia, en estos casos generalmente los materiales más utilizados son: contenido estomacal, hígado, riñón, con menor frecuencia también suele utilizarse cerebro (Pesticidas)  y pulmón. (Cianuros).  En general el órgano utilizado dependerá del tipo de tóxico que se busca. En algunos casos se utiliza sangre obtenida por punción de grandes vasos o corazón que aún luego de 48-72 hs puede hallarse sin coagular  (Alcoholes varios, fundamentalmente etanol – metanol).

Diferentes tipos de muestras procesadas en análisis toxicológicos.

1)             Toxicología forense

·           Estómago.

·           Contenido estomacal

·           Sangre

·           Pulmón

·           Hígado.

·           Cerebro

·           Vesícula biliar

·           Bilis.

·           Humor vítreo

·           Hisopados nasales, vaginales y rectales

·           Pelos

·           Uñas

·           Piel

a)      Provenientes de exhumaciones.

·           Fauna cadavérica.

·           Huesos.

·           Tierra del cajón

b)      Provenientes del lugar del hecho.

·           Bebidas

·           Alimentos.

·           Comprimidos.

·           Medicamentos en general.

·           Pelos

·           Ropas

·           Manchas

2)   Toxicología ambiental

·           Venenos volátiles.

·           Efluentes líquidos

·           Residuos sólidos.

3)   Toxicología Alimentaria.

·      Estudios bacteriológicos.

·      Estudios micológicos.

·      Micotoxinas

·      Aflatoxinas

·      Conservantes

·      Colorantes

4)   Toxicología clínica.

·      Sangre

·      Orina.

·      Vómitos.

·      Contenido gástrico.

·      Pelos

5)   Drogas de uso penado

·      Cocaína

·      Marihuana.

·      LSD

·      Barbitúricos.

·      Opio, heroína, morfina.

·      Anfetamina y derivados. Metanfetamina y derivados anfetamínicos de anillo sustituido.

·      Otras.

Clasificación de Tóxicos.

Se pueden clasificar en:

Tóxicos volátiles. (CO, CNH, etanol, metanol, acetona, formol, compuestos organo-clorados, nitroderivados, benceno, hidrocarburos en general, etc.)

Tóxicos metálicos. (Arsénico, Mercurio, Antimonio, Bismuto, Plomo, Talio, Cadmio, Manganeso, Aluminio, etc.)

Tóxicos orgánicos fijos. (Pesticidas organoclorados y organofosforados, barbitúricos, hidantoinas, glutetimidas, carbamatos, analgésicos, anfetaminas, benzodiacepinas, alcaloides, anestésicos, etc.)

Procesamiento químico analítico de tóxicos

En química en general y en toxicología en particular, es necesario para proceder a la correcta identificación cualitativa y a una adecuada medición cuantitativa separar la sustancia que se desea detectar y/o cuantificar del medio en el cual se la investiga. Es decir lo que denominamos la separación de la matriz.

En el caso que nos ocupa la separación de los distintos tóxicos de las matrices que hemos mencionado: materiales biológicos, sangre, orina, vómitos, contenido estomacal, vísceras, restos alimenticios y de diversos tipos presentes en la escena del evento, etc. es un aspecto de fundamental importancia y que se encara según el tipo de tóxico que se investiga.

Así, en el caso de Tóxicos volátiles, se aprovecha su propiedad de pasar fácilmente al estado vapor para separarlo del resto de los componentes de la muestra. Este procedimiento puede limitarse a conservarlo en un recipiente hermético,  a temperatura ambiente o ligeramente calefaccionado, de modo que el tóxico pase a la fase vapor, de donde luego lo tomaremos como corresponda para su análisis o también efectuar un tratamiento más enérgico mediante una destilación directa o por arrastre por vapor, (Dibujar esquemas) reteniendo los vapores obtenidos mediante el procedimiento con una solución apropiada,  en un recipiente refrigerado.

           

En el caso de Tóxicos metálicos, se aprovecha su característica inorgánica, para proceder a la destrucción de materia orgánica de la matriz (Mineralización), de modo de obtener una solución de sales que tendrá en su composición el catión correspondiente al veneno en cuestión como nitrato o sulfato, el cual es entonces investigado sin las interferencias probables de los componentes orgánicos.

Finalmente en el caso de Tóxicos orgánicos fijos,  se aprovecha su mayor afinidad en solventes orgánicos que en solventes acuosos,  los  que generalmente constituyen la matriz en donde se produce la investigación, de modo que por un procedimiento de extracción  con solventes se produce el traspaso de los tóxicos de una fase a la otra en donde luego se procede a la investigación adecuada.

 

Investigación de tóxicos volátiles.

Se denominan así a aquellos compuestos o elementos de trascendencia toxicológica que independientemente de su estado físico, pueden separarse del material que los contiene mediante destilación directa o por arrastre con vapor de agua. Los mismos generalmente penetran al organismo por vía inhalatoria o por ingestión, es por ello que su investigación puede efectuarse según los casos en sangre o en orina, en tejido pulmonar o en aire expirado. Entre ellos podremos citar el CO (monóxido de carbono), el CNH (Acido cianhídrico) y los cianuros alcalinos, el CH2O (Formol), el NH3 (amoniaco), algunos alcoholes como el etílico y metilico, (etanol, metanol), diversos solventes orgánicos (éteres, aldehídos, cetonas), compuestos bencénicos (Tolueno, Benceno), solventes clorados, (Cloroformo, cloruro de etilo, cloruro de metilo), compuestos nitrogenados (Nitrobenceno, nitrotolueno). Por supuesto que a esta lista podríamos agregar numerosos compuestos más constituyendo los mencionados una pequeña enumeración.

El aislamiento de los compuestos así calificados puede operarse en medio acuoso-ácido o en medio acuoso-alcalino, de acuerdo con sus propiedades químicas. La separación en medio acuoso-ácido permite aislar la mayoría de los compuestos de importancia toxicológica, mientras que la destilación en medio alcalino promueve ciertas descomposiciones que inciden en la investigación analítica toxicológica por su manifiesta interferencia, sobre todo con material alterado.

Comenzaremos por detallar dos sustancias que existen normalmente en estado gaseoso y que generalmente actúan en este estado de agregación: CO y CNH y que por lo tanto no requieren habitualmente el tratamiento mencionado precedentemente.

Monóxido de Carbono (CO)

Se trata de un gas inodoro e incoloro, que se produce por combustión incompleta del Carbono o sustancias Hidrocarbonadas en presencia de insuficiente cantidad de oxígeno. Es por ello que es frecuente en épocas invernales debido a las bajas temperaturas que fuentes de calefacción inadecuadas como braseros, o incluso artefactos de gas con funcionamiento defectuoso y carencia de adecuada ventilación generan este tipo de intoxicaciones por inhalación. Este compuesto inhalado conjuntamente con el aire ve formando una combinación con la hemoglobina, que se denomina carboxihemoglobina, que es mucho más estable que las combinaciones del grupo hemo con el oxígeno y el anhídrido carbónico en la respiración normal, esta estabilidad genera que paulatinamente mayor cantidad de hemoglobina se combine con el monóxido sustrayéndose al mecanismo normal de intercambio gaseoso de la respiración. Simultáneamente,  producto de la carencia de aporte de oxigeno se genera un aumento en el ritmo respiratorio lo que ocasiona el agravamiento de la situación, paralelamente se desarrolla una somnolencia que dificulta la comprensión por parte de la persona que sé esta intoxicando de tal situación continuando el proceso  mencionado.

La carboxihemoglobina (Hb.Fe.CO) posee una coloración carminada intensa, lo que provoca en los afectados una coloración rosada, fundamentalmente en sujetos de raza blanca,  que dista muchísimo de la palidez cadavérica habitual,  por lo tanto este aspecto impresiona al perito orientándolo hacia la causa del accidente o intoxicación, fundamentalmente si el porcentaje de carboxihemoglobina supera el 30 %. Asimismo durante la sesión de la autopsia la pigmentación de los órganos, (cerebro, corazón, pulmones y músculos estriados), está notoriamente incrementada, lo que también alerta a los médicos legistas.

En casos de muertes las muestras de sangre deben obtenerse lo antes posible, del corazón o de las venas de gran calibre, como la femoral, en donde es más probable encontrar aún sangre no coagulada. Se ha demostrado que el CO no es absorbido post-mortem y, por lo tanto, la determinación en sangre constituye un índice de su contenido en el momento del deceso.

La determinación de monóxido de carbono, rara vez requerida en la clínica toxicológica,  puede ser extremadamente importante en situaciones forenses. Esto es verdaderamente particular en investigaciones de muertes con incendios. La presencia o ausencia de carboxihemoglobina ha sido utilizada como un indicador de si el fallecido estaba vivo o muerto, al comenzar el incendio. Este problema impone una rigurosa demanda en el análisis de presición en determinar concentraciones por debajo del 10 % de carboxihemoglobina.

Análisis

a)      Ensayo de dilución (Haldane).

Se preparan dos soluciones de concentración similar (1 %), una con sangre normal y otra con la sangre en estudio. Se observan simultáneamente en recipientes similares, con luz natural, difusa. La sangre normal presentará color rojo amarillento, mientras que la muestra, de contener Hb.Fe.CO (carboxihemoglobina) en concentración suficiente presentará un color carminado neto.

b)      Ensayo alcalino.

En un tubo de ensayo limpio y seco colocar III a V gotas de la sangre en estudio y en otro similar igual número de gotas de sangre normal, agregar 15 ml de agua destilada a cada tubo, mezclar bien, incorporar luego a cada tubo V gotas de sol. de hidróxido de sodio al 10 %, mezclar bien, se observará que la sangre normal acusa color castaño a castaño verdoso, por la presencia de hematina alcalina, mientras que la sangre con Hb.Fe.CO, (más de 10 %),  permanece un tiempo con la coloración carminada.

c)      Identificación espectroscópica.

Las soluciones de oxihemoglobina (Hb.Fe.O) al 1-2 %, observadas al espectroscopio presentan caracteres identificativos en la zona visible del espectro, entre las rayas D y E. La carboxihemoglobina (Hb.Fe.CO) presenta un espectro similar aunque desplazado. La posibilidad de identificar la carboxihemoglobina por vía espectroscópica depende de la concentración de pigmento, poder resolutivo del prisma, etc., generalmente conviene efectuar observaciones simultaneas con diluciones de sangre testigo mediante el acoplamiento al espectroscopio de prismas de reflexión total.

En estas condiciones la dilución de oxihemoglobina presenta dos bandas de absorción: una alfa (ubicada a la izquierda) entre 586 y 566 mu, y otra beta, (ubicada a la derecha), entre 550 y 528 mu, con máximos en 576.9 y 540,4 respectivamente.

La carboxihemoglobina presenta la banda alfa entre 580 y 560 mu y la beta entre 546 y 526 mu, con máximos respectivos a 570 mu y 538 mu.

Como podemos apreciar las diferencias no son demasiado significativas, por lo tanto es necesario poseer una línea de referencia que puede hacerse por volatilización de una sal de sodio o contando con un retículo desplazable en el ocular que permita alinear el retículo con la banda alfa de la dilución de sangre normal y luego presentar la dilución de la sangre con carboxihemoglobina, con la que podremos apreciar el pequeño desplazamiento.

Mucho mas efectivo es la aplicación de un prisma de reflexión total aun con espectroscopios de bajo poder resolutivo, pues permiten ubicar el espectro sobre el ocular y aprovechando la reflexión total una imagen del mismo, por supuesto entonces invertida, en un nivel inmediatamente superior, con lo cual invertimos las posiciones de las bandas alfa y beta, si hacemos coincidir la banda alfa en ambos con sangre normal, dado que la imagen reflejada la podemos desplazar,  observaremos un conjunto de tres bandas, pues la alfa ya hemos dicho que coincide en ambos espectros superpuestos, si ajustamos así el dispositivo y luego reemplazamos por la dilución de sangre con carboxihemoglobina veremos la no-coincidencia de la banda alfa por lo tanto observaremos cuatro segmentos y eso es definitorio.

d)      Determinación cuali o cuantitativa de CO en sangre por microdifusión

Para ello utilizaremos una Cámara de difusión de Conway. La misma es una caja de vidrio, de cierre hermético, que posee en su base un tabique que separa la misma en dos círculos concéntricos, de manera de poder colocar en ambas partes dos líquidos diferentes sin que se mezclen, pero de manera que la cámara aérea de ambas sea común y de esa manera puedan difundir sustancias volátiles entre las dos soluciones.

Para el ensayo propuesto se coloca en el compartimento externo 1 ml de sangre, en el compartimento interno 2 ml de una solución de cloruro de paladio, constituida por cloruro de paladio en ácido clorhídrico 0.01 N, finalmente sobre la sangre agregamos  1ml de solución de ácido sulfúrico al 10 %, como agente liberante. Se cubre con la tapa asegurando un cierre hermético y se deja en reposo una hora a temperatura ambiente. Si en el sector central donde se coloco el reactivo no hay cambio puede considerarse un resultado negativo. De existir monóxido de carbono, aparecerá una pátina grisácea de Paladio metálico.

Se puede cuantificar titulando el Pd⁺⁺ sobrante con una solución de IK.

e)Determinación de carboxihemoglobina.

Se basa en la separación física de la Hb.Fe.CO de otros derivados de la Hb.Fe.O2.

Wolff desarrolló un procedimiento de valoración de la HB.Fe.CO basado justamente en la mayor resistencia térmica de este derivado en condiciones rigurosas, controladas. Así, indica que un calentamiento a 55 ^oC durante 5 minutos exactos provoca en muestras de sangre saturadas de Hb.Fe.CO la precipitación de escasa o trazas de material coloreado junto con otras proteinas incoloras. Al respecto declara Wolff que, de observarse color, ello es imputable a un fenómeno de coprecipitación. La sangre exenta de CO tratada en las condiciones señaladas produce un filtrado amarillo pálido libre de hemoglobina.

Eliminados la Hb.Fe y otros componentes precipitables por este tratamiento térmico, la Hb.Fe.CO puede evaluarse por diferentes vías. Se advierte, acorde con la información que se ofrece, que los mejores resultados se obtienen si la muestra original se divide en dos fracciones y una de ellas es saturada con CO, la cantidad relativa de CO en ambos sobrenadantes será proporcional al por ciento de saturación de la muestra de sangre en estudio. Puesto que los sobrenadantes pueden acusar manifiesta turbiedad, se recomienda efectuar diferentes lecturas en el máximo de absorción, donde la absorción es mínima. Es de señalar que el método de Wolff modificado es utilizado en los laboratorios de U.S.A.

Material necesario.

a)      Generador de CO, es recomendable mediante el tratamiento de ácido fórmico o formiato de sodio, tratados por ácido sulfúrico conc.

b)      Baño de agua. Termostato controlado, calentado eléctricamente, de manera de mantener invariable la temperatura en 55±0.5 ^oC durante 5 minutos.

c)      Centrífuga. Se menciona que aunque la filtración es posible la demora hace que sea recomendable centrifugar a 5000 r.p.m.  en dispositivo para 4 ó más tubos de 10 – 15 ml de capacidad.

d)      Espectrofotómetro. Se indica un filtro colorimétrico para 570 – 630 nm

e)      Solución reguladora. Buffer acetato.

Solución I: en matraz aforado de un litro, colocar 300 g de ácido acético y completar a 1 litro con agua destilada.

Solución II: 408 g de acetato de sodio cristalizado (CH3COONa.3H2O) en un litro de agua destilada.

Mezclar un volumen de sol. I y 3 vol. de sol II, llevar a un litro.

pH 5±0.5

f)        Solución “antiespúmica”. Usar de buena calidad. En frasco de vidrio colocar una fracción del producto y agregar agua destilada, colocar unas “perlas de vidrio”, cerrar bien y agitar vigorosamente. No usar alcoholes superiores pues desnaturalizan la molécula de hemoglobina.

Preparación de la solución sanguínea.

En tres tubos identificados A, B y C, se colocan 0.5 ml de sangre, al denominado A, sangre sin CO (Blanco), al denominado B, la sangre en estudio y al C, la sangre en estudio saturada al 100 % con CO sintetizado a partir de formiato de sodio y ácido sulfúrico. Se agrega a cada uno de los tubos 2 ml de agua destilada.

Pasar un ml de cada una de estas mezclas a tres tubos nuevos, limpios y secos.

Agregar a cada uno 4 ml del buffer de Wolff (pH 5.05)

Colocar en baño de agua a 55^oC

Dejar enfriar

Filtrar

Leer la absorbancia en Espectrofotómetro a 538 y 570 mu.

Cálculos

La saturación relativa de la muestra de sangre original se calcula mediante la ecuación

% Hb.Fe.CO = (A538 – A570) Solución sanguínea no tratada X 100

(A538 – A570) Solución sanguínea saturada

 

Acido cianhídrico y cianuros alcalinos.

Las intoxicaciones con ácido cianhídrico pueden suceder de manera accidental o intencional, el ácido cianhídrico es un gas a temperatura ambiente, que se produce de manera sencilla por hidrólisis de cianuros alcalinos (Na o K), estos últimos  tienen amplia  aplicación industrial en metalurgia, galvanoplastía e industria minera.

También se lo utiliza para aplicar la pena de muerte en la cámara de gas. En todos los casos la producción del ácido cianhídrico se debe a la hidrólisis ácida de los cianuros con un ácido mineral como el Clorhídrico por ej. La acción del ácido sobre los cianuros libera el CNH que como gas es inhalado y de manera casi inmediata produce la muerte por inhibición inmediata de la cadena respiratoria celular. La dosis tóxica de esta sustancia oscila entre 50 y 100 mg. En algunos casos de manera intencional se ingiere o se suministra CNNa o CNK, el cual es rápidamente absorbido produciendo el óbito muy rápidamente. En todos los casos de muerte por cianuros o ácido cianhídrico el material visceral presentará un particular olor a almendras amargas, característico del cianhídrico. Se debe aclarar que un porcentaje de las personas carece de la percepción de dicho olor, por lo tanto se recomienda dada la potencia tóxica del mismo no insistir en tratar de olerlo en estos casos pues paulatinamente se producirá una mayor parálisis transitoria del nervio olfatorio y la inhalación del mismo puede causar efectos riesgosos como ya hemos mencionado dada su baja dosis tóxica.

En el material visceral tanto el agua presente en los tejidos, como la producción de CO2 por el proceso putrefactivo exacerban la liberación del cianhídrico a partir de los aniones cianuros.

CN^- + H2O  -------  HCN  +  OH^-

CO2 + 2 CN^- +H2O----------  2 HCN + CO3⁼

La alcalinidad de hidrólisis en este caso también generará una intensa coloración carminada de los tejidos, tal como con el CO,  pero ahora acompañada del olor a almendras amargas ya mencionado.

1.    Ensayos cualitativos o inmediatos.

a)      Muestras: Cualquiera fuere su naturaleza (vísceras, alimentos) deben acondicionarse en recipientes bien limpios,  secos y de cierre hermético,  sin agregado de sustancia alguna como conservador. El único medio de conservación compatible es el frío que simultáneamente servirá para evitar la volatilidad del tóxico recordando que su PE es de 20 grados centígrados y su PF es de 13 grados bajo cero.

b)      Fundamento: La identificación inmediata del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos se efectúa en forma directa en la atmósfera del recipiente que contiene el material a analizar. La liberación del ácido cianhídrico se debe a un proceso hidrolítico que prosigue en variada magnitud según las condiciones del medio

c)      Técnicas:

Ensayo guayaco-cúprico o de Schonbein

El ensayo se basa en el aumento del potencial de oxidación de las sales cúpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. Si al sistema Cu (II)- cianuro, se acopla un compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidación origina un derivado coloreado, disponemos de un ensayo identificativo.

Reactivos:

a)solución acuosa de sulfato de cobre al 0.5 %

b) solución alcohólica de resina de guayaco al 10 %, de reciente preparación.

Material necesario

a)papel de filtro de 2 x 15 cm

b) cápsula de porcelana.

Procedimiento:

Se humecta el papel de filtro de 2 x 15 cm con la solución de sulfato de cobre 0.5 % hasta 1/3 de su longitud empleando una cápsula de porcelana, escurrir el exceso y luego humectar con la solución de resina de guayaco al 10 %. Colocar el papel en el ambiente interior del recipiente que contiene el material a analizar, de estar presente el ácido cianhídrico el papel pasa de color castaño a azul en forma inmediata.

Interferencias:

a)oxidantes directos de la resina de guayaco.

b) reductores que actúen de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre.

Valor analítico del ensayo: Tiene valor cuando es negativo, ya que es una reacción inespecífica. Cuando es positivo requiere confirmación por ensayos específicos.

Sensibilidad: Es un ensayo altamente sensible. Según algunos autores permite reconocer hasta 0.25 microgramos de ácido cianhídrico.

           

Ensayo con o-toluidina.

El ensayo se basa en la misma interpretación dada para el de guayaco-cúprico. El color azul es imputable a un derivado de estructura meriquinoide, similar al que produce la bencidina.

Reactivos:

a)solución acuosa de sulfato de cobre al 0.5 %

b) solución alcohólica de O-toluidina al 1 %

Material necesario

a)papel de filtro de 2 x 15 cm

b)Cápsula de porcelana

c)Varilla de vidrio

Procedimiento:

Se humedece la tercera parte del papel de filtro con la solución de sulfato de cobre al 0.5% y luego, mediante una varilla de vidrio, extender sobre la superficie humectada I gota de solución alcohólica de O-toluidina al 1%. Colocar el papel en el interior del recipiente que contiene el material a analizar. En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma inmediata la formación de una coloración azul verdoso que rápidamente vira al azul neto. La aparición de color azul tenue por exposición prolongada no tiene significación analítica.

Interferencias, valor analítico:  similares a las del guayaco cúprico.

Sensibilidad: Tiene mayor sensibilidad que el guayaco-cúprico.

Alternativa para mejorar la especificidad de los ensayos anteriores.

Los ensayos anteriores se basan en la oxidación del cromógeno por acción del catión cuproso, el cual se origina a partir de la sal cúprica por la acción reductora del anión cianuro. Es por ello que la presencia de cualquier oxidante volátil, (Hipoclorito, cloro, etc.)  puede provocar la generación del compuesto oxidado y por ende desarrollar color y otorgarle a este ensayo el carácter inespecífico

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Para mejorar sustancialmente la especificidad del mismo se propone efectuar los ensayos anteriores invirtiendo el orden de utilización de los reactivos, es decir en primera instancia exponer el papel impregnado con la sol. alcohólica de guayaco o con la sol. de o-toluidina, y luego de unos minutos sobre la tira de papel y sobre la cápsula de porcelana, agregar unas gotas del reactivo cúprico.

Si la coloración es por un oxidante inespecífico se producirá inicialmente, en cambio si la misma es por acción del anión cianuro se producirá luego del agregado del reactivo cúprico, pues recién entonces el mismo reducido a cuproso por la acción del cianuro será el responsable de la oxidación de la sol. orgánica desarrollándose el color azul.

Ensayo de Magnin.

Se basa en la obtención del denominado Azul de Prusia.

Reactivos

a)solución acuosa de hidróxido de sodio al 2 %

b)solución acuosa de sulfato ferroso al 2 % (Preparación reciente)

c)Acido clorhídrico conc pa.

Material necesario

a)papel de filtro de 2 x 15 cm

b)cápsula de porcelana.

Procedimiento:

Se impregna el papel de filtro con la solución de hidróxido de sodio al 2 % y se expone en el interior del recipiente durante algunos minutos. Se retira y se extiende sobre una cápsula de porcelana. Se distribuye sobre la superficie expuesta IV gotas de la solución de sulfato ferroso al 2 %: aparece un precipitado verde, (hidróxido de hierro II), que se oscurece paulatinamente (hidróxido de hierro III). Se deja al aire unos minutos para favorecer la oxidación del ion ferroso. Se acidifica con unas gotas de ácido clorhídrico concentrado. En presencia de ion cianuro aparece precipitado Azul de Prusia.

Valor analítico

El ensayo de Magnin constituye un recurso analítico categórico para demostrar la existencia de ácido cianhídrico dada su especificidad.

Sensibilidad: es un ensayo menos sensible que los descriptos anteriormente.

Transformación en sulfocianuro

Consiste en tratar el destilado con exceso de solución de polisulfuro de amonio a ebullición, reponiendo el polisulfuro si fuera necesario, luego de 5 minutos, se deja enfriar, se disuelve en agua destilada, se acidifica y se efectúan 3 extractos consecutivos con eter etílico. Finalmente se evapora la fase etérea a BM y sobre el residuo se agregan III gotas de solución de Cloruro Férrico, en caso positivo aparecerá una intensa coloración roja por formación de Sulfocianuro Férrico.  (SCN)3Fe

Aislamiento e identificación del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos.

Cuando se comprueba la presencia de ácido cianhídrico mediante los ensayos antes descriptos se procede a su aislamiento y posterior identificación. Para el aislamiento se realiza una destilación simple o por arrastre con vapor de agua en medio ácido (se acidifica el material con ácido tartárico al 10 %) recogiendo el producto del destilado en unos ml de solución acuosa de hidróxido de sodio al 10 %. adecuadamente refrigerada.  Luego sobre algunos ml del destilado se practica el ensayo ya descripto de Azul de Prusia, en tubo.

Para ello se coloca en un tubo de ensayo unos ml del destilado y se agregan IV gotas de la solución de sulfato ferroso al 2 %. Se calienta suavemente a ebullición hasta aparición del precipitado de color castaño (hidróxido férrico). Se enfría y se agrega c.s. de ácido clorhídrico concentrado. En presencia del ion cianuro aparece color o precipitado azul. En ausencia del mismo aparece color amarillo débil, debido al ion férrico.

Técnicas cuantitativas:

Muestras: Sangre, orina u homogenato de vísceras en presencia de fluoruro de sodio al 1% como conservador.

Fundamento: En la cápsula de Conway el ácido cianhídrico difunde del compartimento externo al interno siendo fijado como cianuro alcalino en una solución alcalina. Se toma una alícuota del compartimento interno y se agrega Cloramina T, formándose cloruro de cianógeno. Luego por el agregado de piridina se forma cloruro de cianopiridina. La acción hidrolítica determina la apertura del anillo glutacónico. Si este derivado se hace reaccionar con ácido barbitúrico se forma un complejo de color lila a violeta que se lee a 580 nm

Reactivos:

a)Hidróxido de sodio 0.1 N

b)Ácido sulfúrico al 10 % en volumen

c)Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina sólida y 1 parte de vaselina

c)Fosfato monosódico 1 M

d)Cloramina T al 0.25 %. Se guarda en heladera hasta el momento de su uso.

e)Reactivo Piridina-Barbitúrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g de ácido barbitúrico, 15 ml de piridina y 3 ml de ácido clorhídrico conc. (deben utilizarse en el orden mencionado). Mezclar hasta disolución total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar.

Material necesario

a)Unidad para micro difusión según Conway

b)Material de vidrio de uso convencional en el laboratorio.

c)Espectrofotómetro visible de buena resolución (1 nm)

d)Cubetas espetrofotométricas cuadradas de 1 cm de paso de luz.

Procedimiento:

Colocar en el compartimento interno de la unidad de micro difusión de Conway 3,3 ml de hidróxido de sodio 0.1 N y en el compartimento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml del homogenato de tejido (aprox. 1 g de tejido). Como reactivo liberante se agregan II a IV gotas de ácido sulfúrico al 10 % en el compartimento externo. Tapar inmediatamente y homogeneizar por rotación.

Tiempo de difusión: 3 a 4 hs a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solución alcalina del compartimento interno y se transfiere a un tubo de ensayo.

Se prepara un blanco colocando en otro tubo, 1 ml de hidróxido de sodio 0.1 N.

A cada tubo agregar 2 ml de fosfato monosódico 1 M y 1 ml de Cloramina T al 0.25 %. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por último 3 ml del reactivo piridina – barbitúrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia del ion cianuro aparece un color lila a violeta cuya absorbancia se mide a 580 nm.

Se compara la absorbancia con testigos de cianuro de concentraciones comprendidas entre 1.0 y 2.0 microgramos por ml de solución de hidróxido de sodio 0.1 N.

Valor normal en sangre

Hasta 15 microgramos por ciento.

Interpretación de los resultados.

El ion cianuro es muy tóxico. En las intoxicaciones por inhalación de gas cianhídrico pueden registrarse valores de 100 ug o más por 100 ml de sangre. Por ingestión de dosis elevadas (200 mg pueden provocar la muerte de un sujeto adulto), la concentración en sangre supera el orden de 1 a 2 mg por cada 100 ml

Venenos volátiles. Destilación en medio acuoso-ácido

El material a analizar, mecánicamente dividido se coloca en un balón de destilación de capacidad adecuada con agua destilada, hasta obtener una papilla fluida, acidificada luego por agregado de solución al 10 % de ácido tartárico. En el recipiente colector se coloca un volumen adecuado de agua destilada, que a su vez puede ser refrigerada exteriormente con hielo. La acidez tártrica confiere al contenido del balón un pH adecuado y evita alteraciones eventuales de ciertos complejos. La destilación, sea directa o por arrastre con vapor de agua, se prosigue hasta recoger 50 a 75 ml de destilado, con esta fracción se procede a realizar una serie de ensayos

genéricos que puede sugerir o excluir la existencia de determinados tóxicos volátiles.

1.- Aspecto. Corrientemente el destilado debe ser límpido, ocasionalmente turbio blanquecino con separación de ácidos grasos de bajo PM, que se destacan en la capa superior del líquido. En ocasiones la turbidez es debida a la existencia de vehículos orgánicos no miscibles con agua, benceno, solventes varios.

2.-Olor. Permite presumir la existencia de determinados compuestos siempre que pueda prevalecer sobre el olor propio que acusan los destilados, habitualmente el olor nauseabundo del  material visceral deteriorado puede enmascarar la percepción  de otros compuestos de trascendencia toxicológica.

3.- Reacción. En estas condiciones es ácido (acético, propiónico). Normalmente el pH debe ser ácido por la generación del CO2, el pH se determina con papeles indicadores o utilizando soluciones de indicadores químicos variados. De todos modos la reacción ácida para ser importante debe estar acompañada de lesiones coincidentes en el material remitido (por ej. estómago). Debe notarse que en intoxicaciones mortales con ácidos clorhídrico (Muriático) o Sulfúrico, no suele determinarse la presencia de los ácidos al estado libre, pues los mismos son neutralizados por la bases de los tejidos destruidos por la acción caústica, allí lo que notaremos es el marcado aumento de los aniones cloruro o sulfato.

4.- Carácter reductor. En tubo de ensayo se colocan 5 ml del destilado y II gotas de sol. de cromato de potasio al 5 %, mezclar y agregar por las paredes del tubo II gotas de ácido sulfúrico puro, procurando que los líquidos no se mezclen. En la zona límite aparecerá, un anillo verde o azul, si existe material reductor. Entre los compuestos de interés toxicológico que dan este ensayo positivo debemos citar: metanol, etanol, formol, etanal, acetona, etc. Tengamos en cuenta que este ensayo puede dar positivo por la formación de productos reductores cuando el material está muy deteriorado por la putresfacción. Por lo tanto debe asignarse más importancia con este ensayo a un resultado negativo.

5.- Acción sobre el ión diamino-plata. Se basa en la propiedad oxidante del ion plata, y en su capacidad de orignar combinaciones insolubles con ciertos compuestos volátiles de importancia toxicológica. A 5 ml de sol. de nitrato de plata al 5 %, colocados en tubo de ensayo limpio, agregar gota a gota c.s. de amoniaco puro hasta disolución exacta del precipitado de oxido de plata. Incorporar 5 ml del destilado, mezclar bien y dejar en reposo durante unos minutos. Puede observarse una reducción parcial (color castaño de intensidad variable): calentar a b.m. hirviente durante unos minutos y enfriar, la aparición de un ppdo negro o castaño oscuro que generalmente sobrenada es imputable a compuestos sulfurados, sin proyección médico legal. En presencia de formol, acetaldehído, cloroformo, fenol, hidrato de cloral, originan espejo metálico sobre la pared del fondo del tubo.

6.- Ensayo de Lieben. A 5 ml del destilado agregar 1 ml. de hidróxido de sodio al 10 % y gota a gota c.s. del reactivo de Lieben hasta color amarillo neto. En presencia de etanol, etanal o acetona, aparecerá en frio un ppdo. amorfo de color amarillo, el que por calentamiento a b.m. y posterior enfriamiento genera un ppdo. amarillo cristalino y un olor característico a iodoformo. El reactivo de Lieben origina iodoformo con todo compuesto que contenga la agrupación CH3-CO-. Si se repite el ensayo pero alcalinizando con NH3 en lugar de HONa, solo la acetona produce el iodoformo por lo tanto esta variante constituye un ensayo diferencial. El Rvo de Lieben es una solución de I2 y IK en agua destilada.

7.- Ensayo de Fujiwara. En tubo de ensayo limpio colocar 2 ml del destilado e igual volúmen de solución de hidróxido de sodio al 30 %, mezclar e incorporar 2-3 ml de piridina pura, agitar y calentar a BM, aparecerá una coloración rosada a roja en la capa piridinica, la piridina debe ser pura y probarse mediante un ensayo en blanco. El ensayo positivo implica la existencia de derivados organoclorados como el cloroformo, el tetracloruro de carbono, tricloroetileno, dicloroetileno, hidrato de cloral, etc.

8.- Ensayo con HONa al 30 %. A 5ml del destilado, agregar igual volumen de sol. de HONa 30 % y calentar a BM hirviente durante 5 minutos, en presencia de nitroderivados aparecerá una coloración amarilla de intensidad variable. Este ensayo es util para detectar al p-nitrofenol producto de la hidrólisis de un plaguicida organofosforado como el parathion.

9.- Formaldehído (Formol) La presencia del formol, puede ser producto del agregado del mismo como conservador, por cierto que por error, ya hemos afirmado que el único conservador que debe utilizarse es la refrigeración. Este produce un aspecto y consistencia típicos al material visceral cuando se agregó con esa finalidad. Pequeñas cantidad del mismo que podrín proceder de una intoxicación pueden detectarse mediante el reactivo de ácido cromotrópico en sol. concentrada de ácido sulfúrico, agregar al mismo luego de agitar vigorosamente II ó III gotas del destilado y calentar a b.m. hirviente, en presencia de formol se generará una coloración borra vino, rojo violeta o violeta

10.- Alcohol metílico.  Su identificación se realiza previa transformación en formol. A 5 ml del destilado se agregan unas gotas de sol. acuosa fosfórica de permanganato de potasio, dejando en reposo, 5 a 10 minutos, por agregado de sulfito de sodio sólido reducir el exceso de permanganato. Sobre la solución límpida se efectúa el ensayo descripto en el punto anterior.

Determinación de alcohol etílico.

Método por microdifusión de Feldstein y Klendshoj

Muestras: Pueden utilizarse sangre, orina,  homogenato de tejido (cerebro – hígado) contenido gástrico.

Condiciones de recolección.

En caso de sangre. No debe utilizarse como antiséptico local alcohol u otras soluciones de sustancias reductoras, ya que interfieren en la determinación. Se aconseja usar solución jabonosa o solución acuosa de bicloruro de mercurio al 0.5 %

Condiciones de conservación de la muestra.

Colocar la muestra en recipientes de plástico con tapa hermética (no usar tapones de goma), conteniendo 2 a 5 mg de fluoruro de sodio (anticoagulante y conservador de preferencia) o citrato de sodio u oxalato de sodio.

Drogas: Todas deben ser de calidad analítica (p.)

Dicromato de potasio.

Carbonato de potasio.

Yoduro de potasio.

Tiosulfato de sodio

Almidón.

Acido sulfúrico concentrado.

Materiales:

Unidad para micro difusión de Conway con su respectiva tapa

Microbureta de 2 ml

Baño de hielo

Material de vidrio convencional de laboratorio.

Reactivos:

Solución bicromatada ácida.

En un recipiente adecuado colocado en un baño de hielo, agregar 600 ml de agua destilada. Con cuidado y agitando agregar 133  ml de ácido sulfúrico

concentrado.

Una vez frío, agregar 19.6 g de Cromato de Potasio y  completar a 1 litro en matraz aforado con agua destilada.

Solución saturada de carbonado de potasio. Usar carbonato de potasio pa.

Solución de yoduro de potasio 3 N.

Solución de tiosulfato de sodio 0.1 N. Debe conocerse su título exactamente.

Solución de almidón soluble al 1 %. Esta solución debe llevarse a ebullición en el  momento de prepararla y se conserva en heladera durante cierto tiempo. Agregar  como conservador 5 mg de yoduro mercúrico por gramo de almidón.

Lubricante: Parafina y vaselina sólida mezcladas en proporción de acuerdo a la temperatura.

Procedimiento:

Se colocan en el compartimento interno de la cámara de Conway 1,0  ml de la solución de dicromato de potasio sulfúrica. En un extremo del compartimento externo se coloca  1.0 ml de sangre u orina; en el otro extremo de la cámara se agrega  1.0 ml del reactivo liberador (solución saturada de carbonato de potasio). Tapar la cámara y hacer girar la misma suavemente sobre la mesa de trabajo. Dejar la cámara 30 minutos a 56 ^oC

Efectuar paralelamente un blanco con agua destilada. Se deja difundir 10 hs a 25^ºC, 6 horas a 37 ^oC ó 2 hs. a 50 ^oC. Una vez cumplido el tiempo de difusión, se destapa la cámara y se procede a efectuar la micro titulación, directamente en el compartimento interno.

Para ello se agrega 0.5 ml de la solución de yoduro de potasio 3 N, se agita con varilla y se comienza a titular rápidamente al principio, y más lentamente luego, con la solución valorado de tiosulfato de sodio 0.1 N colocada en la micro cubeta. Cuando se observa la aparición fugaz del color celeste-verdoso del cromo III, se adiciona una gota de la solución de almidón, y se continúa ahora gota a gota la titulación, hasta desaparición del color azul del yodo.

Se titula el blanco de igual manera, anotando los volúmenes de tiosulfato gastados en cada uno de los casos.

Ecuaciones y cálculos:

 2 Cr207⁼ + 16 H⁺ + 3 CH3CH2OH  -------    4 Cr⁺³  + 11 H2O + 3 CH3COOH

         CH3CH2OH ---------   CH3COOH  +  4 e^-

Cr2O7⁼  +  14  H⁺ + 6 e^-  ----  2 Cr³⁺ + 7 H2O

El PE del alcohol etílico en función de la ecuación Redox debe ser el PM/4, luego 46.06/4= 11.51

Número de  equivalentes =  V.N

Normalidad del S2O4Na2 usado = 0,1 N

Nro. de equivalentes en la muestra = Nro. de EQ de dicromato en el blanco – Nro. de EQ de dicromato en exceso.

1 EQ de dicromato ------  1 EQ de etanol = 11.51

1 EQ etanol -------    11.51 g

                        0,1 (V_B – V_M)------     x gramos de etanol presente en V_S

Donde V_B = ml de tiosulfato gastados en el blanco.

V_M = ml de tiosulfato gastados en la muestra

V_S = ml de sangre u orina colocados en la cámara para el ensayo.

X =  0,1 (V_{B –} V_M). 11,51

Por lo tanto la concentración de etanol presente en la muestra será

Etanol (g/l) = N x (V_B – V_M) x 11.51       donde N es la normalidad del tiosulfato.

                                   Vs       

Interferencias:

En este método interfieren las siguientes sustancias: acetaldehido, alcohol metilico, alcohol isopropilico, propanaldehido, alcohol amílico, octanol y éter etílico. No interfieren acetona, cloroformo, benceno, tetracloruro de carbono, tricloroetileno, etc.

Método de Kozelka y Hine

Es un método oximétrico que presenta la ventaja de excluir varias de las posibles interferencias que se observan en la microdifusión de Feldstein.

Muestras: Sangre u orina.

Drogas:  Todas deben ser de calidad analítica.

Wolframato de sodio.

Hidróxido de sodio.

Cloruro mercúrico.

Dicromato de potasio.

Reactivos:

Solución acuosa de wolframato de sodio al 10 %

Solución de ácido sulfúrico 1 N

Solución acuosa saturada de hidróxido de sodio

Solución acuosa de cloruro mercúrico.

Solución de bicromato de potasio 0.1 N

Acido sulfúrico concentrado pa.

Yoduro de potasio pa.

Solución de tiosulfato de sodio 0.1 N

Solución de almidón soluble al 1 %

Materiales y equipamiento

Dispositivo de Kozelka – Hine.

Baño de María.

Procedimiento:

En el tubo A de la figura se coloca 1.0 ml de sangre y 5 ml de la solución de wolframato de sodio al 10 %. Se mezcla y se agrega gota a gota agitando 5 ml de la solución de ácido sulfúrico 1 N.

En el tubo B se colocan 10 ml de la solución saturada de hidróxido de sodio y 10 ml de la solución de cloruro mercúrico.

Se adaptan los tubos y se coloca agua en el erlenmeyer colector. Se destila por arrastre de vapor de agua hasta recoger 25 – 30 ml. El vaso que contiene los tubos A y B deben calentarse a 90 – 100 ^oC para evitar condensaciones.

Al destilado se agregan 10 ml exactamente medidos de la solución de bicromato de potasio 0.1 N y 5 ml de ácido sulfúrico pa. por las paredes de manera de obtener 2 capas. Cerrar el erlenmeyer con la tapa y mezclar con cuidado.

Se calienta a BM hirviente 20 minutos. Se enfría y se diluye hasta alrededor de 50 ml.

Se adiciona 0.2 g de yoduro de potasio pa. y se mezcla hasta disolución total.

Se titula con solución de tiosulfato de sodio 0.1 N, hasta casi decoloración, se adiciona II gotas de la solución de almidón y se continúa la titulación hasta el punto final (viraje del color azul – violeta al verde).

Ecuaciones y cálculos:

(Vd.Nd) – (Vt.Nt) x 11.51  =  mg Etanol / ml de sangre

Vs

Vd = Volumen de la solución de bicromato de potasio.

Nd = Normalidad de la solución de bicromato de potasio.

Vt = Volumen gastado de la solución de tiosulfato de sodio.

Nt = Normalidad de la solución de tiosulfato de sodio.

Vs = Volumen de sangre u orina utilizado

 

Determinación cuantitativa de alcohol etílico por C.F.G.

Extraer por punción venosa, 10 ml de sangre, acondicionándola sobre heparina como anticoagulante. La punción debe hacerse desinfectando la zona con una sustancia adecuada carente de alcohol etílico. Por ej. una solución de yodo que no contenga alcohol o una solución conteniendo cloruro de mercurio.

La muestra hasta su peritación debe reservarse a 4^oC, hasta el envío al laboratorio en la misma jeringa en que fue extraída con su respectivo capuchón de aguja y rotulada debidamente.

Si la muestra es de orina, se acondiciona en frasco de plástico limpio, bien cerrado e identificado en forma refrigerada a 4^oC.

Técnica

Viales	Nro. 1	Nro.2	Nro.3	Nro.4	Muestra
Sol. testigo de etanol	0,1 g/l  1ml	1 g/l   1 ml	2 g/l   1 ml	3 g/l  1ml	-----------
Sol. de standard interno	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml
Sol. sat. de C03K2	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml
Muestra, sangre u orina	---------	---------	----------	--------	1 ml

Procedimiento

En viales de vidrio de 5 ml de capacidad se agrega a cada uno, 1 ml del standard interno, (solución de alcohol n-propílico 1,5 g/l), a continuación 1 ml de las soluciones testigos de etanol, de las diversas concentraciones propuestas, y al tubo de la muestra 1 ml de la sangre u orina en estudio y finalmente 1 ml de la solución liberante (sol.sat. de CO3K2). Se cierra con tapón de material que no liberen sustancias que interfieran luego en el análisis y finalmente se le coloca un precinto de aluminio. Agitar con rotación suave e incubar a 40^oC en estufa durante 1 hora. Luego se deja estabilizar a temperatura ambiente y se inyecta un volumen de la fase gaseosa en equilibrio con el líquido de cada uno de los viales,  en el Cromatógrafo Gaseoso,  con columna capilar,  170⁰C de temperatura en el horno, inyector a 220^oC,  detector FID a 240^oC. Integrador Merck-Hitachi D-2500ª.

 

 

 

Cálculos.

En el trazado producido por el registrador se verifica el tiempo de retención para confirmar la identidad del volátil detectado, por comparación con los testigos de alcohol etílico, lo que nos permitiría detectar la presencia de otras sustancias volátiles que por poseer poder reductor podrían causar interferencias.

Relacionando la altura de los picos de alcohol etílico y propílico en cada uno de los testigos y las concentraciones de los testigos respectivos,  se obtiene un factor,  que permitirá calcular multiplicando la relación de esos picos en cada una de las muestras analizadas,  la  concentración de alcohol etílico  en g/l en cada una de ellas.

Método enzimático para la determinación de alcohol etílico en líquidos biológicos

            Existen equipos comerciales para efectuar esta determinación los cuales son utilizados en Europa y USA, en nuestro país pueden tener aplicación pero el inconveniente es el elevado costo. Es una técnica accesible para cualquier laboratorio aún de pequeña complejidad, tiene alta sensibilidad y absoluta especificidad, permitiendo la realización en tandas de muestras situación habitual en los laboratorios forenses, como equipamiento solo requieren un espectrofotómetro visible con alcance hasta 340 nm en el UV, cosa que es común en los aparatos visibles de buena calidad.

            La determinación se basa en la acción enzimática que realiza la alcoholdeshidrogenasa sobre alcohol etílico tranformándolo por la sustracción de H en aldehído etílico, la acción de la enzima es absolutamente específica y solo actúa sobre el etanol, el cual en este caso es el “sustrato”.

            Los atomos de H secuestrados por la enzima son cedidos a un nucleotido denominado adenosin di nucleotido (NAD), el cual se transforma en adenosin di nucleótido reducido (NADH), la Absorbancia del NADH es a 366 mu en el UV y la concentración de NADH que se forme será proporcional a la concentración de alcohol etílico en el material analizado.

                                  Etanol + ADH   ----------       Etanal + ADH reducida

                                   ADH reducida + NAD --------   NADH + ADH

            Trabajando con una curva de calibración elaborada con las absorbancias de soluciones testigo de conc. conocida, se interpola en la misma el valor de Absorbancia obtenido con las muestras, obteniendo de esta manera los valores de concentración.

 

 

 

 

 

 

Determinación de alcohol metilico en sangre

Muestras:

Sangre:

No usar etanol como antiséptico, se recomienda el uso de cloruro mercúrico al 0.5 %. Extraer sangre usando como anticoagulante fluoruro de sodio al 1 % y trasvasar a un tubo de plástico provisto de tapa a rosca, llenar totalmente el tubo.

Conservar en la heladera entre 0 y 4º C

En caso de no contar con fluoruro de sodio, usar citrato u oxalato. No usar EDTA ni heparina como anticoagulante.

Líquido cefaloraquídeo u orina.

Recoger la orina sobre fluoruro de sodio al 1 % en recipientes con características similares a las descriptas anteriormente. Conservar en heladera entre 0 y 4^oC.

Fundamento del método:

El alcohol metilico es aislado por microdifusión y posteriormente oxidado a formaldehído, el cual es cuantificado por reacción con el ácido cromotrópico. El complejo obtenido (de color violeta) se lee a 580 nm.

Materiales:

Unidad de Conway Nro. 1

Material de vidrio convencional de uso en laboratorio.

Drogas:

Acido sulfúrico pa.

Carbonato de potasio pa.

Permanganato de potasio pa.

Bisulfito de sodio pa.

Acido cromotrópico pa.

Alcohol metilico pa.

Reactivos:

Solución acuosa de ácido sulfúrico al 10 % (V/V)

Solución acuosa saturada de carbonato de potasio.

Solución de permanganato de potasio al 5 %

Solución acuosa saturada de Bisulfito de sodio (de preparación extemporánea)

Solución acuosa de ácido cromotrópico al 0.5 % (de preparación extemporánea)

Solución madre de alcohol metilico; diluir 1.0 ml de metanol absoluto con cantidad con cantidad suficiente de agua destilada para 1000 ml

Soluciones testigo de alcohol metilico:

Diluir 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 y 10.0 ml de la solución madre con cantidad suficiente de agua  destilada para 10.0 ml y llevar a 100.0 ml con solución acuosa de ácido sulfúrico  al 10 % (Las mismas equivalen a 1,58; 3,16; 4,74; 6,32 y 7,9 mg de  metanol/100 ml).

Vaselina-parafina en la proporción apta para ser utilizada según la temperatura.

Instrumental:

Espectrofotómetro de buena resolución (1 nm)

Cubeta de caras planas, paralelas, de sección cuadrada, de 1 cm de paso de luz.

Técnica:

Microdifusión

Colocar en el compartimento interno de la cámara de Conway, 2,2 ml de solución acuosa de ácido sulfúrico al 10 % (V/V)

Agregar en uno de los extremos del compartimento externo de la cámara, 1 ml de la solución saturada de carbonato de potasio. Tapar parcialmente la misma.

Seguidamente, en el otro extremo del mismo compartimento, colocar 1 ml de la muestra, cuidando de que no entre en contacto con la solución liberadora. Cerrar la cámara.

La reacción se inicia desplazando la cámara en forma circular sobre el plano de la mesa de trabajo.

Dejar difundir 2 hs. a temperatura ambiente.

Reacción de color

Una vez finalizada la micro difusión preparar distintas diluciones del contenido del compartimento interno, (1/2, 1/10, 1/40). Las mismas se realizan en solución de sulfúrico al 10 % (V/V)

Paralelamente se procesa un blanco de reactivos y un blanco de muestra.

Proseguir de la siguiente manera, en tubos de ensayo.

	Muestra	Blanco muestra	Blanco reactivos.
Alícuota del compartimento interno o dilución corresp.	1 ml	1 ml	--------
H2SO4 10 % (V/V)	-------	-------	1 ml
KmnO4 5 % (gotas)	I	-------	I
Dejar en reposo 10 minutos.
Bisulfito de Sodio (una pizca sólida o una gota de solución saturada)	I	I	I
Acido cromotrópico 0.5 %	0,2 ml	0,2 ml	0,2 ml
Colocar en baño de hielo
Acido sulfúrico conc.	4 ml	4 ml	4 ml
Colocar en baño María hirviente 15 minutos.

Enfriar y diluir a 10 ml con agua destilada.

Leer en espectrofotómetro a 580 nm contra ácido sulfúrico concentrado.

El valor de absorbancia obtenido se interpola en una curva de calibración preparada con las soluciones testigos de MeOH a partir de una solución madre de metanol previa sustracción del valor de absorbancia del blanco de muestra.

Cálculos

Metanol (g/l) = X ug. 1.21. 2.2. 0.001. dilución

Donde X = microgramos de metanol obtenidos de la curva de calibración.

1.21 = factor de corrección que se debe usar porque la tensión del metanol no es reducida a cero en el fluido absorbente y el equilibrio de difusión de aproximadamente el 82.5 % de absorción es alcanzado.

2.2 = volumen de reactivo fijador.

0.01      = factor de conversión de las unidades.

Interferencias

La especificidad de la reacción entre el formaldehído y el ácido cromotrópico está indicada por el hecho de que los alcoholes, cetonas y los siguientes aldehídos NO reaccionan para dar compuestos coloreados:

acetaldehido – Propionaldehído – Butiraldehído – Isobutiraldehido – Isovaleraldehído – cloral – Glioxal – benzaldehido – Ftalaldeído – El Gliceraldehído de color amarillo

Los cuerpos cetónicos presentes en la muestra interfieren en la determinación, arrojando resultados falsos positivos. La existencia de formaldehído en alta proporción hace que el método sea inaplicable para metanol.

Es importante tener en cuenta que una concentración superior a 0.8 g/l de metanol es de severo riesgo de muerte para el paciente.

Investigación de tóxicos metálicos

Destrucción de materia orgánica (DMO)

En la mayor parte de los envenenamientos producidos por las “sustancias metálicas”, (metales y no metales), el perito químico antes de proceder a la separación de estas, que se encuentran combinadas a albúminas, formando albuminatos, difíciles de caracterizar por los métodos ordinarios del análisis mineral, debe efectuar previamente la desintegración de la materia orgánica. La investigación y valoración de los iones metálicos de importancia toxicológica se realiza previa Mineralización de la materia orgánica.

Todo procedimiento de mineralización impone la división mecánica del material sólido a fin de favorecer el proceso oxidativo que supone la destrucción de materia orgánica, que se verifica así en forma homogénea, rápida y no tumultuosa, pero si la cantidad de materia resultara reducida o por aconsejarlo la respectiva técnica,  puede emplearse tal cual,  controlando la intensidad del “ataque oxidante” en sus primeras etapas,  al solo efecto de prevenir pérdidas por arrastre mecánico.

La mineralización o DMO puede efectuarse de dos maneras: via seca, calcinación y actualmente mediante la utilización de un dispositivo de microondas de gran potencia,  o por vía humeda: cloro naciente o solución sulfonítrica-perclórica.

a)Método por calcinación (Vía seca)

Consiste en someter la materia orgánica a la incineración, tiene como ventaja su rapidez, sin embargo en toxicología tiene poca aplicación, porque en la investigación de Hg, As y Sb, estos se volatilizan completamente. Se usan cápsulas de Pt o SiO2, pueden agregarse algunas sustancias como OMg, cal, nitratos alcalinos.

Técnica de Strsyzowski.

Indicada para la mineralización en serie, especialmente para As y eventualmente Sb. En cápsula de cuarzo colocar una cantidad determinada del órgano o papilla de vísceras o de otro material orgánico adecuadamente disgregado y agregar luego mezclando bien una solución acuosa saturada de (NO3)2Mg, agregar luego OMg puro y mezclar íntimamente, desecar inicialmente en baño de agua y luego sobre tela metálica y un  mechero hasta comienzo de carbonización. Se prosigue el calentamiento con cuidado pues pueden suceder proyecciones mecánicas del contenido. Finalmente se obtienen unas cenizas blancas o grises, las cuales se procesan disolviendo en solución acuosa de SO4H2 al 10 % o con solución acuosa de ClH.

 

 

b)Mineralización con digestor a microondas.

                Tradicionalmente la “mineralización”,  también denominada “destrucción de materia orgánica” se efectuó mediante el ataque de las muestras con reactivos cáusticos y oxidantes. Así conocemos la Destrucción de Materia Orgánica  con Acidos Sulfúrico y ácido nítrico concentrados o también con la utilización de ácido perclórico. Asimismo por vía seca se efectuaban mineralizaciones con Nitrato de Potasio y Nitrato de Amonio en seco. Todos estros procedimientos son  laboriosos, largos, también con ciertos riesgos ante errores del operador y que exigen disponer de instalaciones apropiadas para la eliminación de los gases que se generan.

            Actualmente se ha propuesto esta operación,  mediante la aplicación de modernas técnicas instrumentales,  que consisten en efectuar el ataque físico-químico, mediante la utilización de energía radiante (microondas) y pequeñas cantidades de reactivos cáusticos oxidantes. . Estas técnicas se ven favorecidas actualmente por disponibilidad de técnicas suficientemente sensibles de detección,  lo que exige que la necesidad de muestra a tratar es notablemente escasa y por ende facilita el tratamiento.

Técnica

            “Destrucción de materia orgánica con calor, ácido nítrico, ácido sulfúrico y agua oxigenada”

·         Muestra requerida 1 gramo de homogenato o 1 ml del líquido biológico

·         Pretratamiento: 24 hs. con 4,5 ml de ácido nítrico concentrado y III gotas de ácido sulfúrico concentrado.

·         Luego, se agregan,  16 ml de ácido nítrico concentrado y 4 ml de agua oxigenada

·         Colocar en el digestor de microondas prefijando el tiempo y temperatura de trabajo. Por ej. 200 ^oC  durante 40 minutos.

·         Evaporación del ácido remanente.

·         Lavado con 30 ml de agua, dos veces consecutivas, evaporando finalmente el agua

·         Concentrar a 1 ml el líquido resultante.

·         Realizar la detección y cuantificación mediante Espectrofotometría de Absorción Atómica.

c) Mineralización por vía húmeda (sulfo – nitro – perclórica)

En un balón Kjedhal, se coloca la papilla de víscera y se agrega ácido nítrico puro. El balón se coloca en BM hirviente hasta disolución total del material sólido, cosa que se verifica con abundante desprendimiento de vapores nitrosos de intenso color leonado. Si no existe urgencia, suele dejarse el material en contacto con el oxidante varias horas. Desapareciendo todo resto sólido en el ataque nítrico, mezclar e incorporar en pequeñas fracciones ácido sulfúrico puro, y una vez atenuado el desprendimiento de vapores nitrosos continuar el calentamiento a BM por más tiempo. Todas estas operaciones deben efectuarse bajo campana con efectiva aspiración para evitar los efectos nocivos de los gases que se producen.

   A medida que el ácido nítrico se va consumiendo disminuye el desprendimiento de vapores nitrosos y comienza entonces el efecto deshidratante y oxidativo del ácido sulfúrico que se traduce en la liberación de vapores blancos de dióxido de azufre comenzando la carbonización del material. Esta situación debe evitarse pues puede generar reacciones no deseadas en el material e incluso puede ocasionar violentas explosiones. Por lo tanto debe suspenderse el calentamiento y reintegrar de inmediato las condiciones iniciales, reponiendo el ácido nítrico, cuando se haya enfriado el material.

Esta operación puede complementarse mediante el agregado de una mezcla de NO3H y ClO4H controlando el calentamiento. El agregado del perclórico debe realizarse en las primeras etapas ya que la liberación de agua del material y el ácido nítrico proveen el grado de dilución conveniente evitando toda posibilidad de explosión.

Teóricamente la mineralización queda satisfecha cuando ha desaparecido todo resto orgánico, prácticamente el tratamiento térmico debe proseguirse hasta eliminar todo exceso de oxidante, por lo cual se calienta intensamente sobre llama hasta liberación franca de humos blancos.

En este procedimiento el ácido sulfúrico actúa como “fijador” de cationes y como vehículo de elementos que integran aniones. En presencia de agua actúa como agente hidrolítico, originando compuestos más simples que resultan fácilmente afectados por los oxidantes, además hace visible la falta de oxidantes, por carbonización y liberación de vapores blancos de dióxido de azufre. Por el efecto hidrolítico que produce favorece la acción oxidante del ácido nítrico y el ácido perclórico sobre hidratos de carbono y prótidos.

El ácido perclórico, cuyo poder oxidante es conocido, pero no interpretado en reacciones de tipo Redox comunes, por tratarse de una mezcla de varios compuestos, según Kahane, supone que produce un clivage de las moléculas orgánicas reduciéndolas a moléculas más simples, sensibles al ácido nítrico.

El ácido nítrico es un oxidante activo, puede utilizarse solo con el ácido sulfúrico, mientras que el perclórico necesita siempre la presencia del nítrico.

Ensayo de Reinch

            Ciertos elementos metálicos y no metálicos en variada combinación y en cantidades mínimas, como el mercurio, arsénico, bismuto, antimonio, etc., son rápida y fácilmente revelados en materiales diversos (vómitos, alimentos, orina, bebidas, polvos, papilla de vísceras, etc.) mediante este ensayo, basado en el intercambio de la carga-ion de acuerdo a la serie de tensiones (electrodeposición). Los elementos mencionados se depositan sobre una lámina de cobre, utilizada como metal colector, en forma neutra el mercurio y el bismuto o en combinación cúprica el arsénico y el antimonio, (arseniuro de cobre),  siendo a posteriori identificados mediante la utilización de ensayos sensibles y específicos.

Técnica.

           

Una fracción homogénea de papilla de vísceras convenientemente dividida, se suspende en c.s. de ácido clorhídrico al 10 %, en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, incorporándose a continuación una laminilla de cobre electrolítico de aproximadamente 1 cm2 de superficie, que previamente ha sido tratada con ácido clorhídrico puro y caliente para eliminar todo resto de óxidos e impurezas. Se calienta sobre tela o BM hirviente durante 30 a 45 minutos, efectuando observaciones periódicas a fin de registrar modificaciones en la laminilla. Si se reduce el volumen de líquido reponer la solución necesaria. Si se observase la aparición de un depósito sobre la laminilla, separarla, lavarla a fin de eliminar materiales adheridos y reservarla para los ensayos identificatorios correspondientes. Sobre la papilla colocar otra laminilla de Cu de manera de proceder al “agotamiento” del mismo.

Identificación del depósito.

            En la actualidad, solo el mercurio y el arsénico, tienen interés toxicológico y es por ello se les da prevalencia aun cuando debe tenerse en cuenta la remota posibilidad del antimonio y bismuto.

            Para el mercurio, que generalmente aparecerá como un depósito grisáceo, se intenta identificarlo mediante la reacción del yoduro cuproso (ICu). Para ello se coloca la porción de laminilla reservada para este ensayo en un tubo de ensayo seco, en la boca del mismo se coloca una tira de papel de filtro impregnada con I gota de solución acuosa de IK y sulfito de sido, y I gota de solución de sulfato de cobre en sol. ClH 0.1N.

Al mezclar ambos reactivos se genera Icu.  A continuación se caliente suavemente el fondo del tubo, para volatilizar el depósito. El vapor de mercurio genera sobre el papel reactivo una coloración salmón o rojo salmón por formación de (I4Hg)Cu2.

            Este simple ensayo nos permite apreciar la presencia del Mercurio, por lo tanto de ser necesaria la cuantificación tomaremos los recaudos necesarios en su mineralización para no perder material durante la mineralización o DMO.

            Para identificar el arsénico, utilizaremos el ensayo de Gutzei. En un Erlenmeyer se colocan 25 ml de agua destilada, 10 –12 ml de ácido clorhídrico puro, luego 0.5 a 1 ml de solución de cloruro estanoso (SnII), mezclar, agregar luego 10 granallas de Zn y colocar como tapón una columna rellena de un algodón impregnado con solución acuosa de Acetato de Plomo, la abertura superior de la columna se cubre con un papel de filtro sobre el que se colocan cristales de Nitrato de Plata los cuales deben ser blancos o incoloros. Otra posibilidad es colocar un papel impregnado en Bromuro mercúrico. El viraje de los cristales de Nitrato de Plata al amarillo que se van intensificando con el tiempo, o de los cristales de bromuro mercúrico a amarillo, que se va intensificando a  naranja o castaño con el tiempo indica la presencia de As.

            La interpretación de lo anterior es la siguiente: por acción del ácido clorhídrico sobre las granallas de Zn se produce liberación de hidrógeno, el cual actuará sobre el arseniuro de cobre en el medio fuertemente reductor que provoca el cloruro de Sn (II), generándose Arsina,  (AsH3) que es un gas y por lo tanto ascenderá por la columna del dispositivo, esa arsina al reaccionar con el Nitrato de Plata o bromuro de mercurio generará los productos mencionados.

            El algodón impregnado con acetato de plomo tiene la finalidad de retener el eventual SH2 que pueda liberarse, que reaccionará con el Pb⁺⁺, formándose SPb de color negro.

Reacciones químicas:

As03H2^- + 6 Cu^o + 8 H⁺  ---------  As2Cu3 + 6 H20 + 3 Cu⁺⁺

As2O3 + 6 H⁺  + 6 Cu^o -----------   As2Cu3 + 3 H20 + 3 Cu⁺⁺

As2Cu3 + 6 H⁺            ------------  2 AsH3   + 3 Cu⁺⁺

2 H⁺    +   Zn^o              ------------      Zn⁺⁺  +  H2

AsH3 + 6 NO3Ag        ------------    AsAg3.3NO3Ag + 3 NO3H       

                                                                                              ^amarillo

          AsH3   +  Br2Hg        -------------     H2As.Hg.Br   +  BrH   (amarillo)

          H2As.Hg.Br  +  Br2Hg -----------     HAs.(Hg.Br)2  +  BrH  (amar. Naranja)

          HAs.(Hg.Br)2 + Br2Hg -----------       As(Hg.Br)3    +  BrH  (naranja)

         As(Hg.Br)3 +  AsH3       -----------       As2Hg3 + 3 BrH        (castaño)

            Si los ensayos para Mercurio y Arsénico dieran negativos, se deberá investigar la eventual presencia de bismuto y antimonio. Para bismuto,  se trata la laminilla de cobre con una solución de NO3H al 20 %, dejando varios minutos en contacto, agitando con frecuencia, luego se diluye con agua y se agrega 1 ml de reactivo iodoquínico, aparecerá un color naranja en caso positivo. El Reactivo iodoquínico se prepara con sulfato de quinina, solución acuosa de ácido nítrico y IK.

            Para investigar antimonio, se trata la laminilla previamente lavada con agua destilada con una solución alcalina de MnO4K, de manera de oxidar el eventual Sb^o a Sb⁺⁺⁺ , posteriormente se trata con SH2, obteniéndose el S3Sb2 precipitado de color anaranjado.

 Investigación de tóxicos metálicos por espectrofotometría de absorción atómica.

            Actualmente se ha hecho muy común la investigación de tóxicos metálicos por esta técnica, fundamentalmente cuando el objetivo es establecer la concentración de los mismos en sangre u orina. Como ya se ha mencionado son numerosas las intoxicaciones o impregnaciones con venenos metálicos en la actividad laboral o por la exposición accidental prolongada a estos elementos y es por ello que se ha propuesto con éxito la aplicación de la AA a estas determinaciones.

            Para evitar la DMO, se ha propuesto otra variante, que consiste en intentar un complejamiento del metal en un reactivo orgánico con posterior extracción en un solvente orgánico no miscible. Esta técnica se ha propuesto para casi todos los metales pesados, destacándose entre ellos plomo y talio, aunque también se la utilizado par todos los restantes metales.

            Básicamente consiste en tratar la orina o sangre, con una dilución del complejante, como tal se utilizan carbamatos, destacándose el pirrolidin carbamato de amonio y el di-tio carbamato de sodio. Estos carbamatos forman complejos estables con los metales pesados de manera inespecífica, dicha especificidad puede mejorarse mediante un ajuste de pH como veremos. Los complejos son fácilmente extraíbles por solventes orgánicos inmiscibles con agua, con lo cual se consigue simultáneamente un notable aumento de concentración, pues se utilizan pequeños volúmenes del solvente orgánico, habitualmente la décima parte del volumen de muestra, con lo cual incrementamos sustancialmente la concentración. (1/10).  La capa orgánica es la que se procesa por absorción atómica aprovechando la selectividad que otorgará la lámpara de cátodo hueco y el monocromador el equipo de AA para optimizar la especificidad de la determinación.

            Para tratar de minimizar el efecto de la matriz sobre el resultado de la absorción atómica de la medición final de la técnica se utiliza la técnica del standard interno, es decir se agrega una cantidad conocida del metal de interés a la muestra de manera que el mismo se vea afectado en la extracción y medición final, de la misma manera que el analito que investigamos en la muestra, y de ese modo dichas interferencias serán absolutamente consideradas en los cálculos.

Técnica.

            Para orina, el esquema básico de la técnica utilizada sería el siguiente:

            En dos ampollas de decantación escrupulosamente lavados y liberados de metales pesados, mediante el lavado exhaustivo con sol. De ácido nítrico y adecuadamente enjuagadas inmediatamente antes de su utilización para esta técnica, se colocan 50 ml de orina a analizar en cada una, esta orina previamente  se ajusta a pH, adecuado según el metal a investigar, para Tl pH 7.0, para Pb 5,5. El ajuste según el pH previo del material se hace o con ac. Clorhídrico o amoníaco.

            A una de las dos ampollas se agregan 0.3ml de una solución del metal a investigar en concentración 50 ug/ml, vale decir que este se diluirá en los 50 ml de orina, generando una concentración adicional de 0.3 ug/ml. (Se agregan 15 ug de Tl o Pb, que diluidos en 50 ml de orina, generan una concentración de 0.3 ug/ml.

A estos volúmenes de orina, se agregan 2 ml de solución acuosa del complejante al 5 %, como ya dijimos el “pirrolidín ditiocarbamato” para el Pb y el “dietilditiocarbamato” para el Tl, se agitan acompasadamente ambas ampollas durante 15 minutos, de manera de facilitar la formación del complejo.

            A continuación se agrega 5ml  del solvente extractante, habitualmente metil isobutil cetona, nuevamente se agitan acompasadamente ambas ampollas durante otros 15 minutos, de manera de facilitar la extracción del complejo a la capa orgánica. La agitación tiene que ser a buen ritmo pero no violenta, para evitar la generación de emulsiones.

            Finalmente se deja en reposo ambas ampollas, observándose la formación de dos fases, la orgánica de menor volumen se ubica en la parte superior y es la que debe reservarse, luego de su separación,  para la lectura por absorción atómica con llama.

            Los valores de Absorbancia de ambos extractos, uno denominado “muestra” (M) y el otro denominado “muestra + T”  (M+T).

            Cálculos:

            El cálculo de la concentración del metal en la orina se hace con la fórmula:

                                         Conc (ug/ml)  =    K (0.3 ug/ml)

                                                                             (1 – K)

           

            En donde K, es el cociente de la Abs. de M / Abs de (M+T), y el otro término es el de la concentración del metal agregado.

            En realidad esta fórmula se basa en el hecho de la abs. de cada espécimen debe ser proporcional a la conc. del analito buscado, es decir la Abs. de M, corresponderá a la concentración del analito presente en la muestra, la Abs. de M+T, corresponderá a la concentración del analito presente más la del analito agregado, y puede demostrarse fácilmente que en la fórmula propuesta se respeta esta hipótesis.

            Para sangre, la metodología propuesta es similar a la descripta, por supuesto que utilizando  volúmenes menores, normalmente 2,5 ml, la prueba se efectúa en tubos de centrífuga previamente tratadas con ácido nítrico como ya se mencionó.

Luego se agrega algún tensioactivo potente, para producir total hemólisis, habitualmente Triton X-100 o similar, una vez hemolizado, a uno de los tubos,  se agrega el estándar interno, del cual deberemos calcular la concentración resultante, a continuación el complejante, en un volumen adecuado a las necesidades, se agita 15 minutos, luego se agrega 0.5 ml del extractante MIBC, a ambos tubos, se agita otros 15 minutos y se deja en reposo para que separen ambas fases. Finalmente se efectúa la lectura por AA con llama.

            Los cálculos se hacen con la fórmula ya propuesta, teniendo en cuenta el valor de la concentración del analito agregado en esta ocasión.

                                                                                                         

Investigación de tóxicos orgánicos fijos

Como ya se ha mencionado la investigación de los tóxicos orgánicos fijos se efectúa aprovechando la mayor solubilidad de éstos en solventes orgánicos que en el agua, de modo que poniendo en íntimo contacto el material a investigar con un solvente orgánico y no miscible con el agua, se aprovecha por partición el traspaso de las sustancias orgánicas de la fase acuosa a la orgánica, recordemos que el 70 % de la masa del cuerpo humano está constituido por agua, de modo que cuando buscamos tóxicos de este tipo en  orina, sangre, vómitos y aún material visceral los mismos se encontrarán en fase acuosa.

El tratamiento de la muestra variará con el tipo de la misma, pero el fundamento será el mismo y consiste en realizar una apropiada transferencia de las drogas a la fase orgánica. Los solventes habitualmente utilizados para esta técnica son el Eter de Petróleo y el Eter etílico, también denominado Eter sulfúrico por su modo de obtención, en ambos casos se aprovecha su carácter de inmiscibles con el agua y su bajo punto de ebullición que facilitará su posterior evaporación.

La extracción no es demasiado selectiva y es por ello que se utiliza una marcha aprovechando ligeras diferencias en cuanto a la afinidad de algunos de los tóxicos de interés, realizándose primero una extracción con Eter de Petróleo, denominando a este extracto “Eter neutro”, a continuación y sobre la misma muestra ya procesada se realiza un tratamiento con Eter Etílico en medio ácido, denominando a este segundo extracto “ Eter ácido” y finalmente sobre la misma muestra se efectúa un tercer extracto ahora en medio alcalino con Eter Etílico, denominando a este extracto “Eter alcalino”. Como puede verse se efectúan tres extracciones sucesivas de modo de recuperar tres grupos de tóxicos orgánicos de interés (Técnica según Fassi, A.M.).

        

Mediante esta técnica que detallaremos a continuación podemos separar los siguientes grupos de tóxicos orgánicos:

“Eter neutro”:  Pesticidas organoclorados y organofosforados.

“Eter ácido”:  Barbitúricos, Hidantoinas, Glutetimidas, Carbamatos, Analgésicos.

“Eter alcalino”: Anfetaminas, benzodiacepinas, Fenotiacidas, Alcaloides, Anestésicos sintéticos, Analgésicos.

Para aprovechar la mencionada selección es imprescindible el orden sucesivo propuesto,  pues de invertirlo y extraer inicialmente con el Eter alcalino en el mismo se extraerían los tres grupos desperdiciándose la posibilidad de seleccionar los tóxicos.

A continuación detallaremos el procedimiento sobre una muestra de orina, la elección de este material se debe a su menor complejidad y también a la mayor frecuencia de realización en el ámbito de los laboratorios de Criminalística.

Se toman 50 ml de orina y se colocan en una ampolla de decantación limpia, se verifica su pH que debe ser 6.5 a 7.0. Este se efectúa con un PHmetro o con papel indicador de pH.  Si la orina fuera de varios días o estuvo mal conservada es probable que su pH sea superior en cuyo caso se debe regular mediante el agregado de adecuadas cantidades de Ac.ClH.

A continuación se agregan 5-10 ml de Eter de Petroleo. Recordemos que el mismo es un corte de HC constituido fundamentalmente por Hexano y Heptano. Se mezcla suavemente por inversión reiteradamente para colocar ambas fases (acuosa-orgánica) en íntimo contacto, de modo de evitar una violenta agitación que podría formar emulsiones no deseadas y que complicarían la posterior operación de la muestra. A continuación se deja en reposo de modo que ambas fases se separen espontáneamente por su inmiscibilidad y diferencia de densidad (la capa orgánica se distribuirá en la capa superior).

Una vez producida la separación neta, se deja escurrir por el vástago de la ampolla la capa acuosa, recogiéndola en un vaso de precipitados limpio. La capa orgánica se retira de la ampolla por el orificio superior colocándola en otro vaso de precipitados limpio e individualizado “Extracto Eter de Petroleo”.

La fase acuosa se vuelve a introducir en la ampolla de decantación y sobre la misma se reitera por dos veces el procedimiento antes mencionado con dos porciones nuevas de 10 ml de  Eter de Petroleo. Haciendo el procedimiento tres veces consecutivas estadísticamente se puede comprobar que el 97 % de las sustancias a extraer pasarán a la fase orgánica lo que garantiza la eficiencia del procedimiento. Las capas de solvente orgánico que se generan en cada extracción se agregarán al recipiente individualizado “Extracto Eter de Petroleo”

Finalizada esta etapa, se procede a acidificar con cantidad adecuada de Ac. ClH la alícuota de orina ya extraída de modo de llevarla a pH 5 – 5.5, lo que se verifica con PHmetro o papel indicador, una vez logrado tal objeto, se coloca en otra ampolla de decantación en donde se reitera por tres veces el procedimiento de extracción en idénticas condiciones a las detalladas y con las mismas precauciones mencionadas, ahora con tres alicuotas de Eter Etílico, las que luego de separadas se acondicionan en un recipiente individualizado “Extracto Eter ácido”.

Finalmente la muestra extraída se acondiciona en una tercera ampolla de decantación procediendo a alcalinizar con amoníaco a ph 9.5 – 10, lo que se verifica del mismo modo ya citado, efectuando a continuación  el procedimiento de extracción por tres veces consecutivas con Eter Etílico. Los extractos así obtenidos se denominan “Extracto Eter alcalino”.

Los tres extractos obtenidos se evaporan a sequedad calefaccionando con baño de agua hirviente o en plancha calefactora, recordemos que los puntos de ebullición de los solventes son bajos y se debe evitar la presencia de llama por su combustibilidad, así como también exagerado calentamiento que podría provocar  una ebullición brusca con pérdida de material.

Los residuos sé redisuelven en un volumen pequeño de alcohol etílico y con el mismo se proceden a sembrar  cromatogramas  en placa, una para cada grupo,  para detectar inicialmente si se hallan presentes alguno de los tóxicos  ya mencionados. Por supuesto que las mismas serán orientativas y con idea de rastreo, de encontrarse algún indicio de tóxico los mismos deben ser verificados y confirmados por otras técnicas, ya sea cromatografía en placas específicas, cromatografía en fase gaseosa, líquida, IR, etc.

Las cromatografías de rastreo utilizan fases móviles diferentes según el grupo de tóxicos investigados.

Para el extracto “Eter de Petroleo, o Eter neutro” puede utilizarse un solvente constituida por Hexano (40), Ciclohexano (40), Cl3CH (10), Acetona (10).

Para el extracto “Eter Ácido” puede utilizarse un solvente constituido por Cl3CH, acetona (80 – 20).

Para el extracto “Eter alcalino” pueden utilizarse o Butanol – AcH (99 – 1) ó Metanol – NH3 (99 – 1).

Los cromatogramas deben efectuarse simultáneamente con testigos de los distintos grupos de drogas mencionadas en cada caso que sirvan de orientación para su individualización posterior.  Debido a que se desconoce la concentración de los eventuales tóxicos presentes es recomendable sembrar al menos tres puntos de la muestra, utilizando distintas cantidades de la misma para asegurarnos entrar en el rango adecuado. Por ej. II gotas, XV gotas y L gotas.

Una vez efectuados los corrimientos, se marca el frente del solvente, se deja secar adecuadamente la placa y se efectúan los revelados correspondientes de manera de lograr una reacción cromógena con los tóxicos que permitan su ubicación en la placa para poder calcular su Rf y también que el color desarrollado sirva de orientación para la individualización de las sustancias o al menos de a que grupo de los mencionados pueda corresponder.

Se debe tener en cuenta que dado el carácter secuencial de la técnica las distintas aspersiones que realizarán deben efectuarse con mucho cuidado y permitiendo el secado entre uno y otro para evitar  lo que denominamos “ el derrumbe de la placa”  con la consiguiente inutilización de la misma.

Para los tóxicos del grupo “éter de Petroleo”, una vez realizado el corrimiento cromatográfico se procede a marcar el frente de solvente y a continuación se realiza el revelado por aspersión secuencial,

a)      Con Solución alcohólica de Difenilamina, con posterior exposición a la luz UV, de ese  modo se ponen en evidencia los pesticidas organoclorados por la aparición de unas manchas de color azul violáceo. A continuación se deja secar la placa.

b)      Se realiza una nueva aspersión, esta vez con solución de Cloruro de Paladio en ácido clorhídrico al 10 %, de este modo se revelan los pesticidas organofosforados que aparecen como manchas amarillo castañas.

Para los tóxicos del grupo “éter ácido”,  una vez efectuado el corrimiento cromatográfico y marcado el frente del solvente, se efectúa el revelado secuencial como sigue:

a)      Sol. de Acetato de Cobalto al 0.5 % en metanol,  para poner evidencia los barbitúricos los que aparecerán como manchas de color lila.

b)      Sol. de Hidróxido de Litio al 0.5 % en metanol.

c)      Sol.saturada de Nitrato Mercúrico, que colorea los barbitúricos de color gris, quedando las glutetimidas e hidantoinas, como manchas blancas sobre un fondo oscuro.

d)      Finalmente una aspersión con solución acuosa de cloruro férrico al 1 % sirve para evidenciar los analgésicos como manchas de color anaranjado-rojizo (Acido acetilsalicilico)

Finalmente para los tóxicos del grupo denominado “éter alcalino”,  luego de efectuar el corrimiento cromatográfico se efectúa la siguiente secuencia de aspersiones:

a)        2-4 dinitrofluorbenceno al 0.5 % en etanol, con este se evidencian las anfetaminas que se colorean de amarillo, sobre un fondo del mismo color.

b)        Sol. concentrada de ácido fosfórico, de esta manera se decolora la placa que vuelve a su original color blanco, quedando las manchas amarillas de las anfetaminas si es que están presentes.

c)      Con solución de ácido clorhídrico al 10 %. Luego se expone la placa al UV y de haber benzodiacepinas presentes aparecerán con una fluorescencia azulada.

d)      Rvo. de Marquis, que consiste en una solución de formol en ácido sulfúrico concentrado, con el cual los alcaloides morfiólicos adquieren una clásica coloración violeta.

e)      Rvo.naftoquinonsulfonato de sodio (NQS), con el cual los anestésicos sintéticos (novocaína, xilocaína, benzocaína, etc.) desarrollan  una coloración anaranjada rojiza.

f)       Rvo. de Draggendorf o Rvo. Iodoplatínico, con el cual todos los alcaloides  y/o sustancias psicotrópicas dan manchas de color rojo o violáceo

Debe tenerse en cuenta que esta técnica debe utilizarse solamente a título de rastreo inespecífico, las sustancias que se detecten deben posteriormente ser correctamente identificadas mediante corrimientos cromatográficos específicos, es decir con solventes y testigos adecuados para la resolución e identificación de una determinada sustancia en un grupo de drogas.

De todos modos actualmente la identificación se efectúa mediante alguna técnica instrumental que permita obtener el espectro de la sustancia investigada, siendo las  más comunes en otras: Espectrofotometría UV, IR, Espectrografía de Masa o Resonancia nuclear magnética